孙权不甘心降曹，但觉得曹操兵多将广，难以抗拒，对举兵抗曹还下不了决心，为此，急召统军在外的周瑜商定大计。周瑜从鄱阳（今江西波阳）星夜赶到柴桑，态度坚定的支持鲁肃，坚决主战。周瑜的理由是：（一）、北方还没有全部平定，盘踞关西的韩遂、马超对曹操身后的威胁甚大，因此曹军难以持久作战。（二）、曹军大都是北方人，不习水战，荆州的降军实乃为形势所逼，未必真心降服，军心不稳。
（三）、现在天气奇寒，曹军远来，战马缺乏饲草，天时对曹不利。就凭此三点，大可与曹操决一死战。诸葛亮游说孙权的话，大体与周瑜不谋而合，于是孙权力排众议，决意联合刘备，共同抵抗咄咄逼人的曹魏大军。孙权任周瑜、程普为左右都督，鲁肃为参军校尉，去和刘备协力御曹。当时双方的兵力对比：曹军大约15、6万，加上荆州降军7、8万，共计二十余万。
刘备实力不济，麾下水陆合兵不过万人，刘琦手下的江夏军，也在一万左右。周瑜、程普的吴军，按《三国志》的记载，大约有3万左右。孙、刘联合起来，也不过五万之众。双方的兵力对比，大约一比五。论实力，可谓众寡悬殊。但在地利以及军队的长处上说，孙、刘联军明显有便宜可占，因为周瑜足智多谋，吴军擅长水战，而黄盖又献上火攻之计，于是可以取长补短，以寡胜众。
当周瑜率三万吴军抵达樊口（今湖北鄂城西北）时，望眼欲穿的刘备欣喜若狂的说：“孙将军决定迎战曹操，真乃英明决策！不知贵军来了几多兵马”？周瑜答：“三万”。刘备说：“可惜人少了些”。周瑜信心满满的说：“这么多已足够了，请使君看我打败曹操”。联军会师后，继续溯江西上，在赤壁（今湖北嘉鱼长江一侧，还有武昌县西赤矶山一说）与曹军前锋遭遇，一场短促而激烈的战斗随即展开，联军牛刀小试，获得胜利。
曹操见初战失利，就引军退驻长江北岸的乌林，与驻军赤壁的孙、刘联军隔江对峙。果如周瑜所料，曹军将士千里跋涉来到南方，水土不服，疟疾、腹泻等疾病迅速在军中流行开来；北方人大都不谙水性，经受不住长江上风浪的颠簸，士卒体质迅速下降，士气低落。 为减轻晕船，曹操祭出昏招：命部队用铁索将战船链起来，上面铺上木板，以增强船只平稳度，降低风疾浪涌时战船摇摆的幅度。
曹军用铁链将战船连接起来，被周瑜部将黄盖发现了，觉得这是一个破敌的大好机会。周瑜采纳了黄盖提出来的火攻之策。周瑜派黄盖诈降曹操，骗取其信任后带着十艘战船，船上满载浸了油的干柴草，趁东风呼呼大作时突然向曹军船阵发起火攻。因战船被铁链绞在一起，情急之下无法解开，火借风势，吞噬一切，曹操的数万水军瞬间灰飞烟灭。
而此时的曹军陆师主力正闹瘟疫，战斗力下降，在孙、刘联军的夹攻下，大败亏输，死伤惨重，曹操不得不搜罗残兵败将退回北方去了。 据记载，曹操逃到江陵时曾清点人数，发现损失惨重，兵力死伤已经超过一大半。周瑜指挥联军水陆并进，衔枚急追，很快抵达江陵城下。曹操心情沮丧，无力再战，只好留曹仁、徐晃守江陵，自率残部仓惶北去。
这就是史上著名的赤壁之战，周瑜是这一大战役的总指挥。他以联军五万之众，一举击溃曹操的近三十万大军，创造了古代战争史上以少胜多、以弱胜强的经典战例。周瑜面对强敌，冷静沉着，客观地分析了敌我双方的长、短之处，及时发现并抓住了曹操所犯的致命错误，巧妙地利用敌军的弱点，扬长避短，出其不意地采用火攻之策焚烧敌船，遂使联军的弱势转化为优势。
赤壁之战后，周瑜指挥吴军乘势围攻江陵（南郡治所）。经一年苦战，周瑜带伤坚持，指挥若定，曹仁见守军伤亡很大，且上游的夷陵已被周瑜袭夺，只好放弃江陵北撤，吴军夺占了荆州之南郡，屡建奇功的周瑜被孙权任为南郡太守。原先没有地盘、到处依附的刘备，乘赤壁大胜，一举占领了原属荆州的长沙、桂阳、零陵、武陵四郡。之后，刘备要求孙权将周瑜占据的南郡借给他。
鲁肃居然支持将南郡借给刘备，理由是给曹操多树一个敌人，而且利用刘备在荆州为孙吴抵挡曹魏的进攻，实乃上上策。孙权同意了鲁肃的意见，不但把南荆州借给了刘备，还把妹妹也嫁给了刘备。周瑜却反对这样做。 他从江陵赶回京口，对孙权说：“如今曹操刚刚战败，还不可能马上进攻我们，请让我和奋威将军孙瑜一起率军西上，攻取益州（四川），再攻占汉中，让孙瑜留守，和西北的马超相互声援。
